Ông bắt đầu học cải lương từ năm 16 tuổi khi đậu vào Nhà hát cải lương Trung ương,[1] tham gai nhiều vở diễn Khi thành phố lên đèn, Đôi dòng sữa mẹ, Sứ giả của tình yêu… Trong đó vở Sứ giả tình yêu, ông đóng cùng Thanh Thanh Hiền, giúp tạo tên tuổi của ông trong lĩnh vực cải lương miền Bắc.[2]

Ông có thời gian 4 năm đi giảng dạy tại khoa Kịch hát Dân tộc, trường Đại học Sân khấu – Điện ảnh Hà Nội.[2]

Năm 1992, ông được phong tặng danh hiệu Nghệ sĩ Ưu tú. Trước khi về hưu, Khôi Nguyên từng giữ một vai trò quan lý tại Nhà hát Cải lương Trung ương.[2]

Bắt đầu đóng phim từ năm 1997, nhưng phải đến năm 2002 ông mới có một vai diễn chính trong bộ phim điện ảnh truyền hình Bác Cả người sung sướng do Trần Lực đạo diễn. Bộ phim cũng giành được giải khuyến khích tại Giải Cánh diều 2002.[3] Cũng trong năm này ông tham gia bộ phim điện ảnh Thiếu phụ chưa chồng cũng với một vai chính.

Tháng 4 năm 2020, ông được bác sĩ chuẩn đoán mắc ung thư tụy giai đoạn cuối, nhưng các con không cho vợ chồng ông biết.[4] Ông qua đời ngày 20 tháng 6 năm 2020, sau khoảng một tháng phát hiện mắc bệnh ung thư tủy.